Illumina二代测序的比力完好的介绍，好比什么是文库，什么是测序深度？

一、测序手艺的开展史

高通量测序（High-Throughput Sequencing）别名下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相关于传统的Sanger测序（Sanger Sequencing）而言的。目前高通量测序的次要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer）（已末行办事），Illumina公司的测序仪（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。

二、各个平台的测序原理

1、454测序仪

将焦磷酸测序应用在测序手艺上。构建的文库（3 和5端别离加上接头），所含接头会使DNA片段连系到微珠上。测序PCR反响就发作在固相的微珠上，而且整个PCR反响和相关的酶被油包水的液滴包裹，每个油滴系统只包罗1个DNA模板。扩增后，每个DNA分子能够得到富集，每个微珠只能构成一个克隆集落。454测序仪的测序通道体积十分狭小，只能包容一个微珠。测序过程中，GS FLX系统会将引物上dNTP的聚合与荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号，就能够到达DNA测序的目标。

2、illumina测序仪

illumina的测序原理是可逆末行化学反响。DNA片段加上接头之后，能够随机的附着于玻璃外表（Flow cell），而且在固相的外表颠末桥式扩增。如许就构成了数千份不异的单分子簇，被用做测序模板。测序采纳边合成边测序的办法，和模板配对的ddNTP原料被添加上去，不配对的ddNTP原料被洗去，成像系统可以捕获荧光标识表记标帜的核苷酸。跟着DNA 3端的阻断剂的去除，下一轮的延伸就能够停止。

3、SOLiD测序仪

ABI Solid手艺的核心是4种荧光标识表记标帜寡核苷酸的毗连反响测序。测序之前，DNA模板通过乳化PCR扩增，和Roche 454的根本不异，只是Solid的微珠更小，只要1μm。3端润色的微珠能够沉淀在玻片上。毗连测序所用的底物是8个碱基荧光探针混合物，按照序列的位置，样品DNA就能够被探针标识表记标帜。DNA毗连酶优先毗连和模板配对的探针，并引发该位点的荧光信号的产生。

4、Ion torrent测序仪

Ion Torrent平台接纳半导体芯片测序原理，利用了一种高密度半导体小孔芯片，该芯片置于一个离子敏感层和离子感触感染器之上，每当有核苷酸分子被掺入时就会释放出量子，而离子感触感染器就会感触感染到那种信号，晓得是哪一个核苷酸被掺入，从而读出DNA序列。

目前支流的测序仪是illumina公司的测序仪，下面次要介绍illumina的测序流程：

三、Illumina测序流程

1 文库构建

1.1 靶基因的文库造备：

靶基因建库一般接纳PCR扩增的办法，同时将测序所需要的接头index序列和添加到靶基因的两头，将差别的样本根据等摩尔比混合后完成文库的构建。

1.2 宏基因组DNA文库的构建：

1) 随机打断。有两种办法：酶切法和随机打断法。常用的是随机打断法。

2) 末端润色。打断的片段是随机断裂，其末端可能是不服的。因而，建库第一步是补齐不服的末端。

3) 添加接头。颠末末端润色后的DNA片段3’末端具有凸起的A尾，而接头具有凸起的T尾，能够利用毗连酶将接头添加到DNA片段两头，构成“Y”形接头。加接头是为了区分样本。

4) PCR扩增。添加了接头的DNA片段，可通过与接头互补的引物来扩增，富集文库。

5) 文库造备的目标是在需要测序的DNA片段两头加上可以与测序仪共同的接头序列。文库造备是决定测序尝试胜利与否的关键

2、簇（cluster）生成

单链化的文库DNA片段进入Illumina测序平台的畅通池（flow cell）后，能够与畅通池外表的寡核苷酸连系，从而进入测序过程。

1) 起首以寡核苷酸（2个）为引物、文库片段为模板停止DNA复造。复造完成后解链，将文库片段洗去，留在畅通池外表的是与文库模板互补的DNA链。

2) “桥”式扩增。单链DNA另一端为差别的接头序列，能够与相邻的另一种寡核苷酸互补连系，停止“桥”式扩增。扩增完成后，本来漫衍在外表的单核苷酸序列酿成漫衍的DNA簇，基因簇在测序时比单分子产生的光信号强良多，更易于检测到。

3)

边合成边测序。畅通池中参加测序引物Read1 SP、DNA聚合酶，连有差别颜色的可逆末行荧光基团的dNTP，一个轮回只能耽误一个碱基，然后肃清游离的dNTP，利用激光扫描，判断是哪种碱基。一个轮回完毕之后就参加一些化学试剂把叠氮基团和标识表记标帜的荧光基团切掉，使3’端的羟基表露出来，再参加新的dNTP和聚合酶进入下一个碱基的测序反响。

4) Read1完毕后，解链并洗掉测序中已经合成的部门，参加测序引物Index引物（也即Read2 SP互补的寡核苷酸），那时会继续在3’端停止复造，读出接头中Index序列，从而能够确定出每个位点的DNA属于哪个文库。

四、454测序流程

1) 文库造备：靶基因或宏基因组的文库构建，经末端修复与特异性接头毗连润色后变形处置收受接管单链DNA

2) Emulsion PCR：单链DNA文库被固定在DNA捕捉磁珠上，乳化，构成油包水的混合物，每个奇特的片段在本身的微反响器里停止独立的扩增，收受接管纯化

3) 测序反响：照顾DNA片段的磁珠被放入Pico Titer Plate（PTP）板中供测序反响利用，它含有160多万个有光纤构成的孔，孔中载有化学发光反响所需的各类酶和底物。测序起头时，放置在四个零丁的试剂瓶里的四种碱基，根据T、A、C、G的挨次依次轮回进入PTP板，每次只进入一个碱基。若是发作碱基配对，就会释放一个焦磷酸。那个焦磷酸在各类酶的感化下，颠末一个合成反响和一个化学发光反响，最末将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反响释放出的光信号实时被仪器设置装备摆设的高灵敏度CCD捕捉到。有一个碱基和序列模板停止配对，就会捕捉到一份子的光信号，由此逐个对应，就能够准确、快速地确定待测模板的碱基序列

五、SOLid测序流程

1) 基因组文库的构建：片段打断并在片段两头加上测序接头，或靶基因扩增添加接头，毗连载体，构建单链DNA文库。

2) Emulsion PCR：Solid的PCR过程也和454的办法类似，但那些微珠比起454系统来说则要小得多，只要1um。在扩增的同时对扩增产品的3’端停止润色，那是为下一步的测序过程做的筹办。3’润色的微珠会被堆积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，堆积小室将每张玻片分红1个、4个或8个测序区域。

3）测序：

SOLiD“双碱基编码原理”本色上是阐了然荧光探针的颜色类型与探针编码区碱基对的对应关系。SOLiD毗连反响的底物是8碱基单链荧光探针混合物。毗连反响中，那些探针根据碱基互补规则与单链DNA模板链配对。底物探针5’末端可别离标识表记标帜“CY5，Texas Red，CY3，6-FAMTM”4种颜色的荧光染料，而且那四种颜色用数字“3，2，1，0”示意；探针3’端1~5位为随机碱基，能够是“A，T，C，G”四种碱基中的任何一种碱基，此中第1、2位构成的碱基对是表征探针染料类型的编码区，“双碱基编码矩阵”规定了该编码区16种碱基对和4种探针颜色的对应关系，而3~5位的“n”暗示随机碱基，6~8位的“z”指的是能够和任何碱基配对的特殊碱基，由上可知，SOLiD毗连反响底物中共有45种底物探针。

单向SOLiD测序包罗五轮测序反响。每轮测序反响含有屡次毗连反响（一般情况下，片段文库是7次，mate-paired文库是5次，所以片段文库共有35个毗连反响，而末端配对文库共有25次毗连反响）。每轮测序反响的第一次毗连反响由与P1引物区域互补的“毗连引物”介导。那五种毗连引物长度不异，但在P1引物区域的位置相差一个碱基（别离用n，n-1，n-2，n-3，n-4暗示），都含有5’端磷酸，所以能够介导毗连反响的停止。第一轮测序的第一次毗连反响由毗连引物“n”介导，因为每个磁珠只含有均量单链DNA模板（也就是每个磁珠外表的单链DNA模板序列都是一样的），所以此次毗连反响掺入一种8碱基荧光探针，SOLiD测序仪记录反响模板序列第1、2位碱基序列的探针第1、2位编码区颜色信息，随后的化学处置断裂探针3’端第5、6位碱基间的化学键，并除去6~8位碱基及5’末端荧光基团，表露探针第5位碱基5’磷酸，为下一次毗连反响做筹办。由此我们晓得第一次毗连反响使合成链多了5个碱基，所以第二次毗连反响得到反响模板序列第6、7位碱基序列的颜色信息，而第三次毗连反响得到的是第11、12位碱基序列的颜色信息… … 以此类推，第一轮测序反响获取了模板链7个碱基对的颜色信息。如图5所示，因为第二轮毗连引物n-1比第一轮错开一位，所以第二轮得到是以0，1位起始的7个碱基对的颜色信息。五轮测序反响反响后，根据第0、1位，第1、2位... …的挨次把对应于模板序列的颜色信息连起来，就得到由“0，1，2，3”构成的SOLiD原始颜色序列。

六、Ion torrent测序流程

1. 文库构建：建库是在样本DNA片段的两头加上尺度的接头。

2. 乳液PCR：Ion Torrent把文库种到测序珠子上去的办法，是做油包水PCR，也叫emulsion PCR（乳浊液PCR）。油包水PCR包罗两个相：油相和水相。此中水相是核心，油相起到分隔感化。

3. 测序：Ion Torrent 测序仪是第一个不需要光学系统的贸易测序仪，接纳半导体测序，通过半导体芯片间接将化学信号转换为数字信号。

七、手艺平台比照

手艺平台特点Roche/454测序手艺1.454平台的凸起优势是读长，每轮测序能产生100万个读长片段，读长可达400-500bp；2.次要的错误来自于同聚物，即不异碱基的持续延伸；3.读出的片段较短，并且不克不及供给配对端点测序信息Illumina/Solexa测序手艺1.每张测序芯片有8个通道，每个通道可零丁运行一个样品，也能够把多个样品混合在一路检测；2.一次尝试可读取大于15亿个碱基/芯片；3.可切确读取反复序列如AAAAAAAA，TTTTTTTT；4.尝试费用低，测序成本为传统测序办法的1/100；5.应用范畴极广，几乎囊括了目前基因组研究的所有办法；6.扩增时容易引入孔增错误累计，招致测序切确度降低ABI/SOLid测序手艺1.SOLid测序平台准确度可以到达99.94%，在片段笼盖率为15×时，测序切确度可接近100%；2.该手艺的读长在2×50bp，可读取序列较短，后续序列拼接同样比力复杂；3.荧光解码阶段，鉴于其是双碱基确定一个荧光信号，因而一旦发作错误就容易产生连锁的解码错误Ion Torrent测序手艺1．无以伦比的快速，2个小时完成测序工做；Ion Torrent的化学测序原理天然简单，无润色的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可到达极小的测序误差和超卓的测序笼盖平衡度。2．测序通量目前还不敷大，增加半导体芯片的容量将有望进步测序仪的处置才能。