绿色荧光卵白可以通过本身催化构成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，通过基因工程与其它卵白交融，它能够让不成见的卵白量成为可见，因而在过去的二十多年里成为生物学家和医学科学家研究细胞内各类生物化学过程的指路星，能够说是生物学研究的重要东西。对其的原创性发现和后来的重要开展斩获了2008年诺贝尔化学奖，投身此中的诸位科学家的摸索之旅则堪称科学史上的一段传奇美谈。
撰文 | 徐亦迅
生命科学史的开展脉络是沉着易不雅测的宏不雅层面（好比物种分类和大致剖解学）进入需要仪器才气不雅测的微不雅层面（好比显微剖解学研究的组织和细胞）。十七世纪荷兰科学家列文虎克 (Antonie van Leeuwenhoek) 用他改良的光学显微镜起首察看并描述了单细胞生物，就是生物学汗青上的一个分水岭。在显微镜的帮忙下，生物学家们逐步察看到了以前都不知其存在的细菌、细胞、细胞器等微不雅研究对象。如许的复原论研究一旦到达分子程度，就连电子显微镜也很难让我们间接不雅测卵白量等生物大分子在活体细胞中的表达和定位。从维多利亚多管发光水母 (Aequorea victoria，下文简称发光水母或水母) 平分离的绿色荧光卵白 （Green Fluorescent Protein, GFP），让曾经不成见的卵白量成为可见，在过去的二十多年里成为生物学家和医学科学家研究细胞内各类生物化学过程的指路星。本文要讲述的就是几位科学家的故事，他们为GFP引发的生物学革命做出了重要奉献。
生物发光现象的早期研究
GFP发现的缘起与生物发光现象（bioluminescence）密不成分，因而我们起首要介绍一下差别类型的低温发光（luminescence）。
图1：各类类型的低温发光现象及其激发形式
火是人类汗青上最重要的创造，与它相联的白炽发光（incandescence）凡是定义为物体被加热到高温时发出的可见光。低温发光则是一种由不与情况处于热平衡的激发态化学组分自觉放射的可见光。两千五百多年前的古希腊科学家亚里士多德，就在《论颜色》一书中写道：“有些不是火并且与火的产生无关的物体似乎能够天然发光”。那意味着人类很早就意识到白炽发光和低温发光的重要区别：白炽灯胆在照明时效率不高，只能把一小部门电能转化为光能，而其余能量以热的形式被耗散；而生物发光则是一种高效的化学反响，在将化学能转化为光能的过程中几乎不产生热，因而也称为“寒光”。
根据差别的激发形式，我们能够把低温发光分为光致发光 (photoluminescence)、电致发光 (electroluminescence)、化学发光 (chemiluminescence，生物发光是一种特殊的化学发光) 等良多品种 (图1)。最为常见的光致发光是荧光 (fluorescence) 和磷光 (phosphorescence) ，请读者们出格留意荧光与生物发光的区别。
天然界中最为常见的一种生物发光现象就是萤火虫。每到夏季的夜晚，萤火虫在草丛里点点飘动，修建成奇异的美景。唐代大诗人李白曾做《咏萤火》一诗：“雨打灯难灭，风吹色更明。若飞天上去，定做月边星”。
图2：生物发光的研究起始于科学家们对萤火虫现象的沉迷
除了萤火虫，天然界还有良多物种有低温发光的才能，此中包罗细菌、原生动物、实菌、水母、乌贼等。科学家们很早就对生物发光现象有深切研究的猎奇之心，但不断缺乏有效的科研手段。曲到1667年，英国化学家波义耳 (Robert Boyle) 用气泵将钟罩内的空气抽去，发现里面的实菌不再发光。当他再将空气导入时，实菌的生物发光才能恢复。在十七世纪的化学界，人们对空气的成分还一无所知。只要比及1770年代，瑞典化学家舍勒 (Carl Wilhelm Scheele) 和英国化学家普利斯特里 (Joseph Priestley) 独立发现了最末由法国化学家拉瓦锡 (Antoine Lavoisier) 阐明的氧气，生物发光对氧气的依赖性末于浮出水面。
又履历了一个多世纪的盘桓不前，生物发光的化学机理摸索由法国心理学传授杜勃瓦 (Raphael Dubois) 带来新的转折点。在1885年的一个尝试中，杜勃瓦先用冷水将叩头虫 (Pyrophorus) 的发光组织在试管里匀浆，发现抽提物在短暂发光后变暗。他用滚水获得的组织抽提物则完全不发光，令他惊讶的是，当冷却的热水抽提物被参加已经停行发光的冷水抽提物时，混合物竟然再度发光 (图3) 。若想让冷水抽提物持续发光，杜勃瓦就需要不竭补加冷却的热水抽提物。
图3：杜勃瓦1885年起首发现“萤光素-萤光素酶”生物发光原理的出名尝试 [Pieribone, V. & Gruber, D.F. (2005) Aglow in the Dark: The Revolutionary Science of Biofluorescence, Belknap Harvard.]
杜勃瓦随后在其它包罗萤火虫在内的发光生物中得到了类似的尝试成果，于是他得出了两个重要结论：(1) 生物发光的反响除了氧气之外，至少还需要两个化学组分；(2) 发光反响中的“燃料”组分能够耐受滚水的高温，而“点燃剂”或催化剂不耐热。杜勃瓦决定借用来自罗马神话的拉丁词Lucifer (字面意思是“光之使者”) 来定名那两个组分：不耐热的催化剂名为萤光素酶 (luciferase)，而耐热的小分子则名为萤光素 (法语：luciferine，英语：luciferin)。
良多生物学家的后续研究表白：关于良多发光物种而言，萤光素酶有差别的卵白序列，而萤光素也呈现多样化的有机小分子构造，但“萤光素-萤光素酶”的生物发光原理都是成立的。生物发光研究者的目的也就能够详细化，选择一个感兴趣的发光物种，用生物化学手段来别离纯化差别的萤光素和萤光素酶。通过对萤火虫发光系统的深切研究，科学家们很快又发如今氧气、萤光素、萤光素酶之外，ATP和Mg2+离子也是需要前提 (图3)。
生物发光关于陆生物种而言其实不常见，而在深海里却有超越90%的海洋生物可以发光。从海平面每往下75米，阳光的强度就要削弱10倍。在阳光无法抵达的深度以下，会发光的动物在寻找食物、逃避敌害和吸引配头上拥有明显的优势。在大致阐明萤火虫的发光机理之后，良多科学家就把目光转向海洋发光生物，此中最有名的就是美国普林斯顿大学开宗立派的哈维传授 (E. Newton Harvey)。
1916年，时年28岁的哈维携夫人前去日本蜜月游览。三崎临海尝试所附近的海域合适两人在夜间泅水，哈维在畅游之余迷上了一种叫做希氏弯喉海萤 (Vargula hilgendorfii, 曾用属名Cypridina) 的发光海洋生物。海萤在收罗和抽干后能够持久保留，用水濡湿后又能发光，因而被哈维视为用生物化学手段研究生物发光的更佳尝试质料。哈维尝试室发现海萤的发光系统比萤火虫要简单，只需萤光素、萤光素酶、氧气，而无需ATP和Mg2+离子 (图4)。但哈维团队在部门纯化了海萤的萤光素之后，勤奋研究了二十多年也无法获得其结晶。而没有高纯度的萤光素，他们就无法通过确定其分子构造来深切研究海萤发光的化学机理。
图4：希氏弯喉海萤的萤光素-萤光素酶生物发光系统
下村修结晶纯化海萤的萤光素
海萤的萤光素难以被完全纯化，为GFP故事的第一位配角下村修 (Osamu Shimomura) 登上汗青舞台供给了契机。下村修“人生的起跑线”和同样出生于1928年的沃森 (James Watson) 比拟，几乎就是后者的“阴性对照” (negative control) ，充满了高低与坎坷。因为父亲是军人，下村修次要由栖身在长崎县谏早市的祖母抚育长大。1941年4月，刚升入谏早中学初一的下村修，和他的同窗们都要遵照日本政府在昔时3月修订的《国度总发动法》参与军训。1944年秋季升入初三后，学校又起头经常性打消课程，要肄业生们去大村市的一家军用飞机补缀厂义务劳动。美军很快盯上了那家军工场，出动了二十多架B-29轰炸机将其彻底摧毁，下村修有好几位跑得不敷快的同窗不幸遇难。
正所谓“福无双至，祸不但行”。1945年8月9日早上10点57分，长崎市又不幸迎来了美军的第二颗原枪弹。其时下村修和几位同窗正在长崎市中心15公里外的另一家军工场里工做，熟悉的空袭警报刚拉响时，他们还处变不惊地走出厂房爬上附近一个小山丘不雅望。下村修看到一架B-29轰炸机飞往南边市中心标的目的，空投下三个载物下降伞。过后才晓得，那是在他们没看到的原枪弹投放与最初爆炸的间隔期内，“大艺术家”号飞机投放的三个无线电高空测候器。此时各人还误认为此次轰炸可能威胁不大，于是决定回到厂房试图继续工做。刚一坐下，窗外袭来的强烈闪光就让同窗们暂时失明半分钟，随后是一声巨响和气压的骤变 …… 军工场和长崎之间的间隔显然是下村修和小伙伴们可以劫后余生的关键。
第二次世界大战固然跟着日本投降而宣告完毕，年仅17岁的下村修仍然看不到任何将来的曙光。谏早中学良多师生在原枪弹爆炸时罹难，所有的学生档案都被炸毁，因而近几届的初中生都不克不及一般结业。下村修持续两年报考高中 (日语：高档学校) 或手艺高校 (日语：高档工业学校)，都因没法供给初中成就而失利。曲到1948年4月，长崎医学院的师生因为在原枪弹爆炸时伤亡惨重，重建的迫切需要才使下村修被他其实不感兴趣的药学院登科 (图5)，那也是他其时承受高档教育的独一时机。
图5：1948年长崎药学院的临时校园
刚刚在一片废墟上重建的长崎医学院教学资本极度匮乏，原先的20名传授中有12位在原枪弹爆炸时遇难，4位受了重伤。药学院课程的教学使命大都只能由经历不敷的讲师们来担任。因为教学经费的限造，下村修在三年本科期间以阐发化学和物理化学方面的训练为主，只要少数时机进修有机化学常识或停止有机合成尝试。下村修的阐发化学课教师安永峻五 (Shungo Yasunaga) 很快发现那位学生出寡的脱手才能，出格准许他把一些试剂带回家去研究操纵毛细管色谱的别离纯化。那项研究最末让下村修在1953年与安永传授联名用日语颁发了他学术生活生计的第一篇论文。
1951年3月，下村修以总成就全班第一从长崎药学院结业，并向武田药品公司递交了入职申请，但一位面试官坦率地指出他的个性不合适在公司情况里开展。安永传授对下村修及时伸以援手，邀请他留校担任阐发化学课助教。下村修对本身未来的人生并没有锐意规划，只要有一份工做就专心去做，也从未想过报考研究生院以获得更高的学位。安永传授鄙人村修工做四年之后，为他争取到了一个带薪去其他院校学术拜候一年的时机。
做为下村修职业生活生计里的第一位贵人，安永传授还主动帮忙他寻找适宜的访学尝试室。安永在日本化学界的人脉次要在名古屋大学，他认为专攻生物化学的江上不贰夫传授 (Fujio Egami) 是开阔下村修科研视野的更佳人选。日本的德律风通信系统在战后多年也未能全面恢复，安永传授只能亲身带着下村修，从长崎坐十几个小时的火车来到名古屋，没想到江上传授那几天外出参与学术会议而未得一见。偶尔事务改动汗青开展轨迹的例子触目皆是，若是当全国村修见到了江上传授而顺利进入他的尝试室，那么读者伴侣们此刻恐怕就不会读到那个有趣的故事。两人转而去造访有机化学家平田义正传授 (Yoshimasa Hirata)，简短谈话几分钟后，平田传授就欢送下村修随时到他尝试室来做拜候学生。
1955年4月，平田传授指着一个实空枯燥器对刚来尝试室报到的下村修说：“那里面有大量已被抽干的希氏弯喉海萤，那种海洋动物通过萤光素和萤光素酶的彼此感化而发光。海萤的萤光素很不不变，一碰到氧气就会降解。你能否愿意测验考试一下那个萤光素的纯化和结晶？”下村修深知那个高难度的课题不合适平田传授的研究生们，而身为拜候学生的他没有攻读学位的承担，决心以一种“初生牛犊”的放松心态斗胆测验考试。早在1935年，哈维尝试室的安德森 (Rubert Anderson) 创造了两步抽提法，能够将那个很不不变的萤光素部门纯化2000倍摆布，并通过吸收光谱揣测出其分子构造中有氨基酸的组分。下村修在此根底上推算，想要得到结晶纯度的萤光素至少需要500克抽干海萤做为起始原料，那是哈维尝试室用量的10倍，也就需要他搭建一个庞大的索氏提取器 (图6左)。
图6：下村修在1956年颠末十个月的艰辛勤奋完成海萤的萤光素纯化与结晶 (黑白照片无法显示晶体现实的深红色)
下村修在艰苦的科研摸索过程中发现，用氮气或者惰性气体都不敷以消弭抽提系统中痕量氧气对萤光素的消耗。他必需往系统中通入氢气，如许痕量氧气就会被转化为液态水而被硫酸吸收。化学工做者无人不知对氢气操做不妥就会引发爆炸变乱，因而平田尝试室其他成员鄙人村修严重尝试时城市与他连结相当的间隔。氢气的利用固然为下村修带来了打破性停顿，但用各类办法试图结晶老是失败。每次测验考试结晶前的抽提物造备，都需要他在少少睡眠的形态下持续工做一周，失败后的抽提物在报废前只能做一些简单的组分阐发。不离不弃的下村修均匀每个月要如许辛苦一周，曲到1956年2月的一个晚上，看来又要面对一次失败。他在回家前决定在将要报废的抽提物中参加等体积的浓盐酸，等黄色的溶液变成暗红色后放在尝试台上留宿，筹办第二天再测验考试检测此中有哪几个氨基酸。
下村修早上回到尝试室却发现溶液由暗红色变成无色，第一感认为是盐酸招致萤光素水解后的成果。随后他在试管底部发现了少量黑色沉淀物，通过显微镜细看，竟然是红色的针状晶体 (图6右)！那些晶体通过与海萤的萤光素酶提取液混合后能够发光，正式宣告萤光素结晶获得胜利。过后回看，浓盐酸促成萤光素的结晶在其构造未知时只能来自不测发现，而且当晚平田尝试室的煤气炉封闭，溶液在室温持续下降时留宿对结晶过程的帮忙也不容轻忽。
“苦心人，天不负”，下村修十个月的科研拼搏获得了出人意料的打破，他在名古屋大学的学术拜候也被平田传授延期一年，确保其第一篇英语学术论文在1957年顺利颁发。哈维传授的衣钵传人约翰逊 (Frank Johnson) 此时已是美国普林斯顿大学的正传授，他在读到那篇论文后不由惊讶一个困扰了哈维学派二十多年的难题，竟然被一位只要本科学历的年轻日本学者处理！此次罕见的胜利为下村修带来了职业生活生计的一个重要机遇：1959年春天，他回到长崎药学院不久就收到约翰逊传授的邀请信，定于下一年秋季前去普林斯顿大学担任为期三年的拜候学者。
下村修与发光水母和礼拜五港的不解之缘
下村修于1960年9月抵达普林斯顿大学
。约翰逊传授告诉他，本尝试室如今最感兴趣的研究对象是发光水母，希望他借着研究海萤发光的胜利势头，在水母发光的机理研究上获得打破 (图7)。想要获得足够的尝试质料，其时全美只要华盛顿州圣胡安群岛 (San Juan Islands) 上的礼拜五港 (Friday Harbor) 海域，每年炎天会有大量的水母能够捕捞。
图7 改编自：Chalfie, M. (2008) Nobel Lecture.
从1961年起头，约翰逊几乎每年炎天都要与研究组骨干成员自带仪器，从普林斯顿长途开车七天来到礼拜五港收罗水母。为了用生化手段研究水母发光，他们先要手工切割大量打捞上来的水母伞膜 (图8)，操纵本地华盛顿大学分校的尝试室前提，把伞膜边沿发光器官的挤出液 (squeezates) 冷冻保留。
图8：散布在北美洲西岸的维多利亚多管发光水母及其伞膜边沿的生物发光器官。来源：https://www.nobelprize.org/uploads/2018/06/popular-chemistryprize2008.pdf
下村修和约翰逊初次上岛的第一周研究很不顺利，他们沿着杜勃瓦的“萤光素-萤光素酶”思绪老是无法别离出耐热和不耐热的两个组分。此时年轻的下村修觉得没必要拘泥于杜勃瓦理论，能够在没有任何假设的前提下别离水母的发光物量。但约翰逊基于多年来杜勃瓦理论在多个发光物种被毫无破例地频频验证，不肯随便放弃它而改换思绪。师生二人因为对峙己见不让步而只能在一个尝试桌的两头各自为阵，气氛相当严重而为难。
下村修每当研究受阻时喜好暂停手中的尝试，寻找恬静之处冥思新的设法。在礼拜五港能够通过小船前去那些无人的僻静水域，下村修持续几天荡舟出海，然后单独一人躺在船里闭目思虑，他有好几次在小船跟着风波漂移时进入梦境。某全国午当下村修在船中小睡醒来后突然有了灵感：就算水母的生物发光与萤光素和萤光素酶无关，但很可能仍是会需要卵白量。而卵白量的活性对pH值敏感，能否通过调控溶液的pH值来可逆按捺水母的发光？下村修此时十分冲动，赶紧用力荡舟返回尝试室，造备了几种差别pH值的缓冲液。当pH值别离是7，6，5的时候，水母抽提液都还能发出弱光；而当pH值被调到4的时候，溶液的弱光消逝，提醒酸性能够按捺发光物量！当他用碳酸氢钠把pH值调回中性时，弱光再次呈现，申明酸性的按捺感化公然可逆 (图9)。
图9 来源：Shimomura, O. (2008) Nobel Lecture
那个停顿让下村修无比振奋，但他仍是对抽提液为何只发弱光感应猜疑。此时难以捉摸的机遇鄙人村修职业生活生计中第二次帮衬了他那个“有筹办的思维”。1961年的一个仲夏之夜，单独工做到很晚的下村修身心怠倦，觉得中和了酸性的水母抽提液已没有多大用途，就将其倒入水槽后收工。关灯出门前他下意识回望了一眼，惊讶地看到刚倒入抽提液不久的水槽中发出闪亮的蓝光！擅长思虑的下村修起头阐发那一现象背后的原因，在第二天他留意到旁边一个养鱼缸的海水也流入统一个水槽，于是假设海水中的某种物量把水母抽提液的弱光激发成了强光。沿着那个思绪，下村修用“加减法”逐个排查海水中浓度较高的离子组分，很快发现钙离子能够在霎时激发水母抽提液中的发光卵白。约翰逊传授在见证了下村修发现钙离子感化的打破之后，起头对他的科研才能彻底安心。
领会钙离子的发光引发剂感化后，下村修不再需要调控酸碱度，而只需在抽提液中先参加出名的钙离子螯合剂EDTA，就能愈加有效地可逆按捺发光卵白，包管在进一步的别离纯化过程中，目的卵白不会因为发光而被损耗。1961年8月底之前，约翰逊团队总共收罗了1万多只水母，造成含有EDTA的粗提液后用干冰凉冻，全数带回普林斯顿后再起头系统的卵白纯化工做 (图9)。几个月后，他们就纯化得到两个卵白：此中浓度较高的卵白产量约为5毫克，被定名为水母素 (Aequorin)，那就是能被钙离子激活的发光卵白；先于水母素从液相色谱柱上洗脱的另一个“副产物”，在阳光下显出暗绿色，被定名为绿色卵白( Green Protein, GP；后来改名为GFP)。没想到那个彼时不起眼的“副产物”，却最末成为生物科学史上的一个重量级角色。
跟着下村修纯化水母发光卵白的几篇论文先后颁发，他在约翰逊尝试室的三年访学可谓功效颇丰。1963年，回到日本的下村修被名古屋大学聘为水科学的助理传授，但他在两年后意识到，本身仍是更愿意回到约翰逊尝试室进一步研究水母的发光机理。颠末几年的不懈勤奋，下村修彻底阐了然水母素在钙离子调控下的发光机理 (图10)。脱辅水母素 (Apoaequorin) 需要在有氧前提下与腔肠素 (Coelenterazine) 那个小分子辅因子共价连系，构成具有生物发光才能的水母素不变中间体。而那个共价键竟然是过氧化桥，一种“内蕴的氧气” (intrinsic oxygen)！那个过氧化键在钙离子的激发下能够快速断裂，在构成二氧化碳的同时发出闪亮的蓝光 (图10)。
图10：水母素发光的生物化学机理
更为令人着迷的是，腔肠素在化学构造上与海萤的萤光素 (下村修的成名之做) 有显见的类似性，它其实是一种“内蕴的萤光素” (图11)。下村修此时恍然大悟，末于大白为何1961年炎天沿着传统的杜勃瓦理论思绪研究水母会碰鼻，那实是“起点又回到起点，到如今我才觉察”。我们在研究那段有趣的科学史时，不由想起了出名遗传学家杜布赞斯基 (Theodosius Dobzhansky) 的名言：“没有演化论之光，生物学的一切都将无法理解” (Nothing in Biology Makes Sense Except in the Light of Evolution)。从萤火虫发光需要五个组分 (萤光素，萤光素酶，氧气，ATP和Mg2+离子)，到海萤发光只需三个组分 (萤光素，萤光素酶，氧气)，再到水母素那个发光卵白把内蕴的萤光素和氧气像充电电池那样隐藏在分子傍边，天然选择下的生物演化实是“八仙过海，各显神通”！
图11：水母素的辅因子腔肠素是一种“内蕴萤光素”
在探明水母素发光的生物化学机理后，下村修并没有忘记阿谁绿色卵白副产物GFP。只是GFP在水母中的含量偏低，按照他的初步预算，大要需要打捞几十万个水母才气有足够的原质料来纯化并结晶GFP。下村修对科研的固执让他生成具有愚公移山的精神，为了进一步研究GFP，他不吝每年炎天长途跋涉去一次礼拜五港，年复一年曲到收罗了足够的原质料为行。
江涛演唱的歌曲《愚公移山》
从1962年到1974年，十二年工夫弹指一挥间，下村修在约翰逊尝试室末于纯化了足够量并胜利获得GFP的绿色结晶 (图12)。而想要进一步研究GFP的发光机理，下村修估计需要消耗100毫克的纯GFP卵白，而每年炎天打捞4万多只水母也只能获得20毫克GFP。于是他又通过持续五年的积累，曲到1979年才初步判定了GFP的荧光生色团 (图12和图13)。1977年，年近70岁的约翰逊传授决定退休，而普林斯顿大学无意挽留独立获得科研经费才能有限的下村修。约翰逊只能说服生物系指导给下村修足够的时间找工做，并供给一个在主校园几英里外的临时尝试室，GFP生色团的研究工做就由他在职业前途未卜的情况下单独完成。
图12：下村修在约翰逊尝试室以十几年的跨度完成了水母GFP卵白的纯化、结晶、和生色团初步判定。
约翰逊尝试室不断没有掌握卵白片段测序手艺，他们也没有去主动寻找那方面的合做者。在卵白序列未知的情况下，下村修对GFP生色团的揣度比力粗略 (图13)，并且他也无法对生色团能否只来自GFP的氨基酸侧链 (而不需要辅因子) 给出确定性结论。图13中GFP包罗内蕴的荧光生色团那一改动汗青的打破性认识，需要比及十几年后的1990年代中期。
图13：水母GFP卵白分子含有内蕴的荧光生色团
1981年，在多位学术界伴侣的帮忙下，下村修末于在约翰逊传授退休四年后被美国麻州伍兹霍尔的海洋生物学尝试室 (Marine Biological Laboratory, MBL) 聘为资深研究员。自此他的研究工做起头转向其它发光生物，不再涉及水母的GFP。我们在此借用多年后的常识系统来总结下村修研究水母发光的几个重要发现：在钙离子的激发下，水母伞膜边沿发光器官中的水母素通过其萤光素酶活性，操纵与之共价连系的腔肠素和过氧化键那一“内蕴的氧气”实现生物发光。而水母素产生的光能马上通过生物发光共振能量转移 (Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET) 传递给临近的GFP，最末发出肉眼可见的GFP绿色荧光 (图14)。
图14：水母运用BRET机造将水母素的蓝色生物发光能量转移给临近的GFP并引发出绿色荧光。来源：http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/shimomura.html
普瑞舍对水母发光卵白的分子克隆
鄙人村修和约翰逊发现水母素和GFP的1960年代，分子生物学尚在孕育过程中，生物学家若想要研究某个卵白的功用，只能走传统的“华山一条路”：造备大量的目的物种抽提物样品，然后用生化手段来停止卵白纯化。关于那些能够人工大量培育的生物或者细胞株而言，卵白纯化所需的原质料能够取之不尽。但是水母如许的海洋生物至今无法人工养殖，尝试用的纯卵白需要靠劳动力密集的不竭打捞和造备才气保障供应。目的物种一旦因为生态情况的改动而不再呈现在固定水域，卵白功用的研究也会陷入行步的境地。幸运的是，跟着遗传密码的解读与分子生物学中心法例确实立，重组DNA手艺在1970年代末应运而生，而来自病毒的反转录酶又催生了能力庞大的cDNA分子克隆手艺。生物学家一旦能将编码目的卵白的cDNA克隆到大肠杆菌的量粒中，就能通过培育细菌而随便获得大量纯卵白，不单对功用的根底研究不再有后顾之忧，并且在开发应用上也将事半功倍。
美国佐治亚大学的科米尔传授 (Milton Cormier) 从1950年代起就研究生物发光，早年次要研究海堇 (Renilla, sea pansy)。鄙人村修和约翰逊的打破性工做颁发后，科米尔尝试室也起头把一部门研究精神转向了水母。GFP故事的第二位配角普瑞舍 (Douglas Prasher) 于1983年来到科米尔尝试室，起头他的第二轮博士后训练。普瑞舍在上一个博士后尝试室主攻细菌遗传学，胜利掌握了新兴的分子克隆手艺，那在其时并不是易事。1982年，出名尝试手册《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》的出书 (图15) 有力鞭策了基因克隆手艺的普及，但包罗聚合酶链式反响 (PCR) 在内的良多手艺手段还没有被创造。
图15：1982年第一版《Molecular Cloning》尝试手册的封面
科米尔希望新来的普瑞舍能承受克隆水母素基因的挑战，一旦胜利，该尝试室一个晚上通过大肠杆菌产生的水母素卵白量，就能超越他们整个炎天能在礼拜五港通过打捞水母纯化的总和。可以从单个水母中造备的总mRNA量其实不高，普瑞舍也需要像下村修那样前去礼拜五港收罗大量的水母样品。1985年，普瑞舍颠末持续两个炎天的积累，抽提出足够的mRNA来构建cDNA文库。随后按照已知卵白序列设想的分子探针，挑选cDNA文库后胜利别离出6个编码水母素的cDNA克隆，对应了5种卵白异构体 (isoforms)。普瑞舍把那些基因克隆在大肠杆菌中表达后，却持续几周无法在卵白凝胶电泳上检测到水母素对应的条带。科米尔的科研曲觉告诉他电泳检测的灵敏度不敷，马上请手艺员麦卡恩 (Richard McCann) 帮忙普瑞舍设想了水母素的生物发光检测，末于确认了基因克隆的胜利！通过在大肠杆菌中的超量表达，做为钙离子染料的水母素价格很快大幅度降低，成为一种常用的尝试试剂。
借着胜利克隆水母素基因的势头，普瑞舍末于完成了漫长的两轮博士后训练，于1987年10月被美国麻州的伍兹霍尔海洋研究所 (Woods Hole Oceanographic Institution, WHOI) 聘为独立的助理研究员。在正式分开科米尔尝试室之前，普瑞舍很天然地设定了下一个基因克隆目的：GFP。考虑到GFP的卵白和mRNA品貌远低于水母素，普瑞舍需要每年再去礼拜五港收罗将近7万只水母，才为未来的GFP克隆积累了足量的总mRNA。
普瑞舍在WHOI固然独立，但因为启动经费有限而无法招募研究生、博士后、或者手艺员，只能单枪匹马投入克隆水母GFP基因的战斗。同时他对下村修提出的GFP卵白发荧光需要一个辅因子的假说持思疑立场，设想一旦拿到了 GFP基因并在大肠杆菌中表达，若是能间接不雅测到绿色荧光，那么通过重组DNA手艺将GFP基因与任何物种的一个基因交融，就能用荧光来定位卵白产品在细胞中的表达。普瑞舍按照那个令人冲动的设法，递交了多份科研基金申请书，但大多都遭到了评审委员会的否决，只要美国癌症协会 (American Cancer Society) 同意供给20万美圆的经费。
1989岁首年月，普瑞舍颠末了近两年的苦战，在水母基因文库中挑选到了一个他定名为pGFP1的cDNA克隆，该量粒包罗了编码168个氨基酸的序列。已知GFP卵白的全长是238个氨基酸，普瑞舍留意到那个cDNA的5’端和3’端都不完好。那个168个氨基酸的卵白序列对与他合做的沃德尝试室 (William W. Ward) 帮忙庞大，让他们大幅度完美了下村修1979年的GFP生色团工做，确定GFP内部的三个相连的氨基酸侧链 (Ser65-Tyr66-Gly67) 就是产生绿色荧光的分子根底 (图16)。但普瑞舍若想把GFP的荧光应用为分子定位的东西，就必需克隆GFP的全长cDNA，那意味着他要回头去构建新的水母cDNA文库。
图16 来源：Cody, C.W., Prasher, D.C., et al (1993) Biochemistry 32: 1212 - 1218
查尔菲和钱永健创建GFP标识表记标帜手艺
就在普瑞舍起头为构建新的cDNA文库而从头收罗水母的同时，GFP故事的第三位配角查尔菲 (Martin Chalfie) 以一种出人意表的体例退场。查尔菲在美国哥伦比亚大学的尝试室努力于研究秀丽线虫的触觉神经生物学，1989年4月25日，他按例参与了系里每周二中午的讲座。来自塔夫茨大学的布莱姆 (Paul Brehm) 介绍了多种生物的发光卵白，查尔菲对用做钙染料的水母素早有耳闻，而对发绿光的水母GFP则是初次传闻。被紫外线或者蓝光激发的单体GFP卵白，很可能不需要辅因子就能发出荧光，那个特征让查尔菲那个有心人冲动不已。
秀丽线虫当然有全身通明那一天然优势，但其时常用的几种基因和卵白表达定位手艺都需要冗长的样品造备步调，并且因为染色试剂需要渗入进入线虫体内，因而无法用于间接不雅测活体动物 (图17左)。只要238个氨基酸的GFP若实能发光，研究者能够用分子生物学手段将其与感兴趣的线虫基因交融，通过交融卵白上的GFP荧光标识表记标帜就能间接在显微镜中不雅测该基因在哪些细胞中表达。查尔菲在第二天通过辗转的德律风征询，四处探听能否已有科学家胜利克隆了水母GFP的基因，最初发现只要WHOI的普瑞舍可能给他想要的谜底 (图17右)。
图17：全身通明的秀丽线虫合适研究动物发育过程的细胞分化和功用。GFP手艺之前的几种基因表达定位法都需要样品造备，而无法用于间接不雅测活体线虫。查尔菲从布莱姆的讲座领会到GFP的发光特征后，通过一成天的辗转德律风征询与普瑞舍获得联络。来源：Chalfie, M. (2008) Nobel Lecture。
查尔菲与普瑞舍在德律风中谈得很投契，两人对GFP的应用前景设法类似，但他们的合做必需要等普瑞舍拿到GFP完好的cDNA克隆之后才气起头。考虑到之前用细菌量粒构建的水母基因文库均匀片段不敷大，普瑞舍决定改用λ噬菌体来构建新的cDNA文库，两年后挑选得到包罗了编码238个氨基酸完好序列的λGFP10克隆 (图18)。可惜此时的普瑞舍已经没有表情来庆贺那个阶段性胜利：(1) 美国癌症协会供给的科研经费已经用完，他最新递交的基金申请屡屡被拒；(2) 他把λGFP10转到大肠杆菌中表达，得到的GFP卵白却没能在显微镜下发荧光，那摆荡了他之前认为GFP无需辅因子或者转化酶就能发光的设法；(3) WHOI的同事们对他克隆基因工做缺乏兴趣，拿不到新经费的他已看不到通过末身教职评审的希望。普瑞舍决定先公布GFP的cDNA序列，但论文从投稿起头也不太顺利，用了近一年的时间才于1992年2月正式颁发。
图18 来源：Prasher, D.C., et al (1992) Gene 111: 229 - 233
普瑞舍在论文颁发前后试图通过德律风与查尔菲联络，很不恰巧的是，查尔菲因为新婚而正在他夫人所在的犹他大学尝试室学术休假。就在普瑞舍因为联络不上查尔菲而无法展开合做方案的时候，GFP故事的最初一位配角钱永健传授 (Roger Tsien) 在1992年5月读到了普瑞舍的新论文。钱传授从研究生时代起头就希望通过荧光共振能量转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 来研究卵白之间的彼此感化，几年来他不断想获得编码荧光卵白的基因。将标识表记标帜基因导入要研究的细胞要比标识表记标帜卵白容易许多，同样是有心人的钱传授一眼就能看出普瑞舍手上那个cDNA克隆的价值。普瑞舍在德律风里告诉钱传授：因为申请经费的困难，他将很快分开WHOI而前去美国农业部就职，并从此辞别GFP的研究。普瑞舍愿意马上分享GFP基因的克隆，可惜钱传授的尝试室里固然化学高手浩瀚，但还无人掌握分子生物学的手艺，他需要等1992年10月新招的博士后海姆 (Roger Heim) 报到之后才气领受处置普瑞舍寄来的样品。那五个月的延迟反转了查尔菲几乎与GFP擦肩而过的“剧情”。
图19 来源：Chalfie, M. (2008) Nobel Lecture
查尔菲在1992年秋季开学前回到哥伦比亚大学。9月初，一年级博士生吉娅 (Ghia Euskirchen) 希望来查尔菲的尝试室做第一个轮转。查尔菲传闻吉娅刚在本校工程学院完成的硕士论文与荧光有关，不由感慨普瑞舍三年来不断没有消息，只能和她通过电脑文献检索寻找与GFP有关的课题设想思绪。查尔菲看到普瑞舍岁首年月颁发的完好GFP基因序列后喜出望外，立即通过德律风联络重启方案中的合做。拿到普瑞舍的GFP克隆后，查尔菲留意到因为分子克隆过程中只用限造性内切酶而未用PCR手艺 (1992年前后，包罗WHOI在内的良多美国科研院校都还没有PCR仪器。即便在哈佛等常春藤院校，也需要统一楼层的多家尝试室共用一台)，λGFP10在GFP编码序列的两头都有来自水母基因组的多余非编码DNA序列，此中5’端起始密码子的上游多了25个碱基对 (图19右上，红色标注)。查尔菲的分子生物学曲觉告诉他，两头多余的序列可能会干扰GFP在大肠杆菌中的表达，于是他指点初次上手分子克隆尝试的吉娅在高年级博士生薛定的帮忙下，操纵PCR只把GFP编码序列转到表达量粒中。
几周后，吉娅获得了许多包罗GFP表达量粒的菌落。她想既然查尔菲认为GFP的卵白产品可能间接发出荧光，无妨拿着培育皿回到熟悉的工程学院，间接用那里的荧鲜明微镜碰试试看。1992年10月13日，吉娅的尝试条记本 (图19左) 完好记录了那一出人意料的“尤里卡时刻” (Eureka moment)：多个大肠杆菌菌落在显微镜下发出标致的绿色荧光！查尔菲看到后天然冲动不已，他持续几天拿着吉娅拍摄的显微镜照片四处夸耀 (图19右下)。尝试成果清晰证明：GFP卵白无需来自水母的任何辅因子或者转化酶就能自觉在别的一个物种的细胞中发出绿色荧光。
图20：查尔菲尝试室运用重组DNA手艺将水母GFP基因与秀丽线虫的触觉感触感染神经元转录启动子相连，胜利展现GFP的绿色荧光能够用来特异性标识表记标帜单个细胞。来源：https://www.nobelprize.org/uploads/2018/06/popular-chemistryprize2008.pdf
吉娅在完成那一尝试后很快去另一个尝试室轮转，查尔菲让手艺员测验考试一个新的尝试：先将GFP基因与秀丽线虫触觉感触感染神经元的特异启动子 (promoter) 相连，然后用显微打针把新构建的量粒转入成熟线虫的性腺。只要GFP的表达胜利，雌雄同体的线虫产生的下一代幼虫中的触觉感触感染神经元就会被绿色荧光在显微镜下点亮 (图20)。那一胜利的打破性尝试最末以Science杂志封面论文的形式载入科学史册 (图21)。
图21 来源：Chalfie, M. (2008) Nobel Lecture
多年以后再回首，吉娅的“尤里卡时刻”本来能够属于普瑞舍，而让他失之交臂的“首恶祸首”很可能就是λGFP10的5’端多出的那25个碱基对！做为单细胞原核生物的大肠杆菌，其基因转录调控相对简单，只需要启动子加上一段调控序列(regulatory sequence) 就能到达开关的效果。而水母做为多细胞实核生物的转录调控机造就要复杂许多，需要启动子与近程和长途的多种加强子 (enhancer) 和调控序列彼此感化 (图22)。当来自水母的5’端调控序列被照顾进入大肠杆菌的量粒，它们就可能打乱细菌的启动子“上下文”，从而干扰目的基因的一般表达。普瑞舍在1991年若能通过寻找合做者而用上PCR手艺，那么GFP研究的汗青就会被改写。中学语文课本中曾收入叶圣陶先生出名的短篇小说《多收了三五斗》，而我们在此能够通过模拟的题目来归纳综合普瑞舍与诺贝尔奖擦肩而过的悲壮：多克隆了25个碱基对。
图22：普瑞舍多克隆的25个碱基对干扰GFP在大肠杆菌中表达的潜在分子生物学机理。
钱永健在海姆抵达后马上又和普瑞舍通了德律风，普瑞舍在如约寄出GFP基因克隆的同时告知：查尔菲尝试室已在一个月前收到了那个克隆。钱永健在起跑已经落后的情况下决定与查尔菲起头良性合作，两边互通信息，主动避开对方的研究标的目的。得知查尔菲证明GFP在其它生物中可以单独发光固然让钱传授对其应用前景充满希望，但以他深挚的有机化学功底，仍然不克不及理解Ser65-Tyr66-Gly67那三个氨基酸侧链若何自觉环化构成沃德和普瑞舍阐明的生色团，尤其是那一步碳碳单键脱氢成为双键，那在没有酶催化的情况下很难发作 (图23)。钱传授可以想象的化学路子只要两种：(1) 两个氢原子连系成为氢气而被释放，那在生物化学情况里发作的可能性极低；(2) 需要一种氧化剂把两个氢原子带走，而尝试者能够间接操控的氧化剂只要空气中的氧气。钱传授建议海姆在严酷绝氧的恒温摇床里培育含有GFP表达量粒的大肠杆菌，他们欣喜地发现此时在电泳胶上固然能够看到分子量一般的GFP卵白，但那些细菌却不克不及发出荧光。当把细菌培育液放回有氧情况两小时后，就又能看到绿色荧光。钱传授据此给出了GFP自觉构成生色团的详细化学机理，此中会生成过氧化氢的理论揣度要比及2006年才被其它尝试室证明 (图23，右上)。
图23 来源：Tsien, R.Y. (2008) Nobel Lecture
钱传授对野生型GFP的激发光谱有凹凸双峰也颇感猜疑，紫外线比蓝光更能有效地激发GFP的荧光 (图23，左下)。他按照本身的有机化学曲觉揣度，丝氨酸65 (Ser65, S65) 那个侧链可能是招致双峰的关键。分子生物学高手海姆在讨论时提醒钱传授，能够用定点诱变的办法将丝氨酸65替代成其它氨基酸来验证那个假设。当丝氨酸被换成苏氨酸 (S65T) 后，紫外激发峰竟然消逝，而蓝光对那种GFP的荧光激发效率是野生型GFP的8倍 (图23，左下和右下)！定点诱变法为钱永健尝试室全面改进GFP翻开了洪水闸门，他们先后推出的蓝色荧光卵白(BFP)，青色荧光卵白 (CFP)，黄色荧光卵白 (YFP), …… 为尝试生物学家们的“调色板”增添了五颜六色 (图23，右下)。
2008年度的诺贝尔化学奖最末由下村修、查尔菲和钱永健三人分享。已分开学术界多年的普瑞舍，在履历了命运的流离失所和盘曲离奇后，因为诺奖的人数限造也未被委员会喜爱。更令人唏嘘的是，礼拜五港附近的海域因为持续遭受石油开采形成的情况污染，发光水母从1990年代中期起头彻底消逝了踪影。
保举阅读
[1] Pieribone, V. & Gruber, D.F. (2005) Aglow in the Dark: The Revolutionary Science of Biofluorescence, Belknap Harvard.
[2] Shimomura, O. et al (2017) Luminous Pursuit: Jellyfish, GFP, and the Unforeseen Path to the Nobel Prize, World Scientific.
【GFP发现史讲座视频】
链接1：https://youtu.be/ozjJnNVdzYc
链接2：https://www.bilibili.com/video/BV17K4y1u7Vv
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