退火温度＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8） 只是粗算，有时不灵，但比较简便，用primer5计算，引物配对好后，primer5可以显示Tm，我认为这个值就是退火温度，我的经验再加2 or 3度最好，如何给一段序列增加一个酶切位点？经过PCR后引物和目的基因连在一起，酶切位点自然也连上去了，楼主，你可以根据需要，引入不同的限制性内切酶的酶切位点， primerpremier设计引物如何保存？不懂的话继续问， 引物退火温度？
pcr退火温度如何确定？
退火温度＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8） 只是粗算，有时不灵，但比较简便。
用primer5（or oligo6）计算，引物配对好后，primer5可以显示Tm，我认为这个值就是退火温度，我的经验再加2 or 3度最好。
如何给一段序列增加一个酶切位点？
你可以设计带有酶切位点的引物，对目的基因进行PCR，就可在目的基因上引入酶切位点。步骤：引物设计（借助软件）——合成引物（公司合成）——PCR。最重要的一个仪器就是PCR仪了，具体的加什么试剂，加多少，我想楼主应该是做分子生物学，这些应该挺清楚的了。楼主，引物一般是用软件设计，例如Primer.5，你根据你的目的基因两端的特点，设计合适的引物，然后在引物上再添加酶切位点 ，例如EcoRⅠ 是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下： 5' G↓AATTC 3' 3' CTTAA↑G 5' ，你就可以在这两条引物上分别添加这几个脱氧核苷酸，这不就在引物中引入酶切位点了吗？经过PCR后引物和目的基因连在一起，酶切位点自然也连上去了。楼主，你可以根据需要，引入不同的限制性内切酶的酶切位点。
primerpremier设计引物如何保存？
设计好后，点左上角的“edit”，再点“copy”，然后选择正向引物或反向引物，点击后就已经复制到剪切板里了。然后打开word、txt或者exel文件，直接ctrl+V粘贴即可。 ———————————————————————— save to database是存入了PP5自己的数据库中。就像这样： 然后你在下面选中你的引物，点export，就存进了数据库中，然后你可以编辑名字之类的。 不懂的话继续问。
引物退火温度？
Tm指的是把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。我们PCR时候，当然不能用Tm值来作为退火的温度。一般来说，退火温度比Tm值要低上5度左右。但是这个也不是绝对的。建议你如果说模板比较充足的话，做一个梯度试验。范围在Tm值周围10度左右，如果说在这个范围内可以得到一个明显的结果就可以确定。如果说仅仅看到一个趋势，那么你还需要继续扩大这个梯度的范围来确定。