MTT实验前期细胞密度如何确定，怎么计算药物浓度？g0od在线电影
MTT实验前期细胞密度如何确定，怎么计算药物浓度？
⒈抉择稍微的细胞接种浓度。
1般情状下，96孔培植板的1内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培植时间，以保证培植终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成数量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏锐性降低，太少看察不到差异。⒉药物浓度的设定。1定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的领域先初筛。依据自己初筛的结果缩小浓度和时间领域再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。⒊ 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输进excel表，最后得到不同时间点的抑制率转变情状，画出转变的曲线，曲线什么时候变得平整 了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。⒋培植时间。200ul的培植液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难保护68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期慢慢趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。⒌MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以致使MTT比色OD值的升高。⒍理论未必都是对的。要依据自己的实际情状调整。⒎实验时应设置调零孔，对比孔，加药孔。调零孔加培植基、MTT、2甲基亚砜。对比孔和加药孔都要加细胞、培植液、MTT、2甲基亚砜，不同的是对比孔加化解 药物的介质，而加药组加进不同浓度的药物。⒏避免血清骚乱。用含15%胎牛血清培植液培植细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸取值。由于试验本底增加，会试验敏锐性。因此，1般选小于10%胎牛血清的培植液进行。在呈色后，尽量吸净培植孔内残余培植液。MTT 溶液的配制方法 一般，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培植基中，用0.22μm滤膜过滤以除往溶液里的细菌，放4℃ 避光保存就可以。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。需要注重的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 领域内。MTT1般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我1般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培植板中加，没必要1下子配那么多，特别当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏锐；往96孔板加时不避光也没有关系，究竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉. 配制MTT时用用PBS化解 ，也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
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